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Neurologie. Mesurer l'activité des neurones grâce à des implants de protéines photosensibles

Les échanges entre neurones se font, chez tous les animaux disposant d'une amorce de système nerveux, par l'émission de l'équivalent d'un courant électrique provenant du noyau de la cellule et se propageant à un neurone voisin via les dendrites et les synapses. Pour mesurer ce courant, les neuroscientifiques insèrent généralement des micro-électrodes dans le cerveau, dans une zone proche de celle de l'échange qu'ils veulent analyser.

Mais cette méthode ne peut être utilisée facilement. D'une part elle est invasive, obligeant à pénétrer le crâne. Ceci est difficile, même lorsqu'il s'agit de souris que l'on veut par définition conserver vivantes et relativement actives pour observer leur activité cérébrale. D'autre part, l'électrode ne mesure que des courants assez forts, et se trouve perturbée par de nombreux phénomènes se déroulant dans le même temps au niveau du cortex.

Des chercheurs du MIT, dirigés par le Pr Edward Boyden, viennent d'annoncer (voir références ci-dessous) que, pour remédier à ces difficultés, ils ont mis une méthode utilisant la lumière pour détecter le courant électrique entre neurones. Cette méthode est plus facile d'emploi et surtout permet de mesurer, milliseconde par milliseconde, les échanges entre plusieurs neurones à l'occasion de l'exécution d'une tâche déterminée.

Une méthode dite l'optogénétique https://fr.wikipedia.org/wiki/Optog%C3%A9n%C3%A9tique avait été précédemment mise au point à l'initiative d'un neurologue de Stanford, Deisseroth. Karl . Elle associe l'optique à la génétique. Elle permet de rendre des neurones sensibles à la lumière en combinant le génie génétique et l'optique. Elle reposait jusqu'à présent principalement sur l'insertion au niveau cérébral des gènes codant pour une protéine photo-activable, c'est-à-dire réagissant à la lumière. Elle est d'origine bactérienne et a été appelée l'opsine. Son insertion dans le génome du neurone de la séquence génétique codant pour la production de l'opsine se fait par l'insertion d'un virus déterminé qui infectera les cellules de la zone où elle sera injectée. Elle s'intègre dans le génome de la cellule infectée, lui permettant de produire une quantité suffisante de protéine y compris dans les prolongements les plus fins des cellules, les dendrites.

Edward Boyden, qui avait participé à la mise au point de cette méthode, reprochait aux molécules fluorescentes utilisée, dont l'opsine, des temps de réponse trop lents, de leur capacité à détecter des changements de voltage rapides, et leur manque de résistance à la lumière. Ils ont développé en échange un robot capable d'analyser des millions de protéines et d'orienter l'évolution de certaines d'entre elles selon une méthode d'évolution dirigée dite directed protein evolution https://en.wikipedia.org/wiki/Directed_evolution

Ils ont réussi en utilisant cette méthode à obtenir une nouvelle protéine ayant toutes les qualités requises, qu'ils ont nommé Archon1. Une fois que le gène codant l'Archon1 est introduit dans une cellule particulière, la protéine s'insère dans la membrane de celle-ci, ce qui permet le plus facilement possible de mesurer son activité.

En pratique, quand des cellules comportant l'Archon1 sont exposées à une lumière d'une longueur d'onde déterminée, rouge-orange, elle émet une lumière rouge de plus grande longueur d'onde dont l'intensité correspond au voltage en millivolts du courant produit par la cellule lors de l'accomplissement d'une tâche déterminée.

Ils n'ont jusqu'à présent utilisé ce procédé que pour mesurer l'activité d'une tranche (encore vivante) de tissu cérébral de la souris, comme celle des neurones d'embryon naturellement transparents de larves de poisson-zèbres ou du ver d'un millimètre, lui-même transparent, nommé Caenorhabditis elegans très utilisé dans les recherches en biologie https://fr.wikipedia.org/wiki/Caenorhabditis_elegans

On est encore très loin, on le devine, de faire apparaître les échanges neuronaux d'un animal supérieur (tel l'homme !!!). Par contre, concernant la souris, les chercheurs vont désormais utiliser ces premiers résultats pour observer les échanges entre neurones d'une souris vivante se livrant à des tâches variées.

On admirera, mais ceci aujourd'hui ne surprend plus personne, l'exploit que constitue ce travail de neuro-analyse à des échelles microscopiques.

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Commentaire

MIT researchers have developed a light-sensitive protein that can be embedded into neuron membranes, where it emits a fluorescent signal that indicates how much voltage a particular cell is experiencing. This could allow scientists to more effectively study how neurons behave, millisecond by millisecond, as the brain performs a particular function. (credit: Courtesy of the researchers

Présentation

* The researchers made 1.5 million mutated versions of a light-sensitive protein called QuasAr2 (previously engineered by Adam Cohen's lab at Harvard University and based on the molecule Arch, which the Boyden lab reported in 2010). The researchers put each of those genes into mammalian cells (one mutant per cell), then grew the cells in lab dishes and used an automated microscope to take pictures of the cells. The robot was able to identify cells with proteins that met the criteria the researchers were looking for, the most important being the protein's location within the cell and its brightness. The research team then selected five of the best candidates and did another round of mutation, generating 8 million new candidates. The robot picked out the seven best of these, which the researchers then narrowed down to Archon1.


Abstract of A robotic multidimensional directed evolution approach applied to fluorescent voltage reporters

We developed a new way to engineer complex proteins toward multidimensional specifications using a simple, yet scalable, directed evolution strategy. By robotically picking mammalian cells that were identified, under a microscope, as expressing proteins that simultaneously exhibit several specific properties, we can screen hundreds of thousands of proteins in a library in just a few hours, evaluating each along multiple performance axes. To demonstrate the power of this approach, we created a genetically encoded fluorescent voltage indicator, simultaneously optimizing its brightness and membrane localization using our microscopy-guided cell-picking strategy. We produced the high-performance opsin-based fluorescent voltage reporter Archon1 and demonstrated its utility by imaging spiking and millivolt-scale subthreshold and synaptic activity in acute mouse brain slices and in larval zebrafish in vivo. We also measured postsynaptic responses downstream of optogenetically controlled neurons in C. elegans.

Source

A robotic multidimensional directed evolution approach applied to fluorescent voltage reporters. https://www.nature.com/articles/s41589-018-0004-9.epdf

 


 


 

05/03/2018
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